《表1 PCR引物及反应条件Tab.1 Primer sequence and reaction condition in PCR proce-dure》

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《eIF4E在肾透明细胞癌组织中的表达及意义》

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将组织块剪切成小块后放入平皿（置冰袋上预冷）中的钢网上，按照Fast 200总RNA提取试剂盒操作步骤，加入DEPC处理的PBS，收集过滤的悬液，RA2液500μL，洗涤，离心，获得总RNA。按照TransGen反转录试剂盒操作说明，EP管中加入4.0μL总RNA、1.0μL随机引物、反转录酶（200U/μL）1μL、trans reaction 10.0μL，加入DEPC水至终体积为20μL。25℃10min，42℃30min，85℃5min，终止反应获得cDNA产物。查阅NCBI，找出eIF4E及β-actin基因全长。采用Primer 5.0软件进行设计引物，交由南京金斯瑞生物公司合成。引物及反应条件见表1。PCR过程:采用25μL体系（上下游引物各1.0μL，cDNA 3.0μL，mix12.5μL，ddH2O 8.5μL），反应条件:预变性94℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃45s，共30循环；72℃10min。PCR产物进行20mL/L琼脂糖凝胶电泳，每孔加样6μL，同时加PCR Marker，电压100V、电流50mA进行电泳40min，紫外灯检测并照相，Bandscan软件测定各条带灰度值，以目的条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示，进行统计分析。