《表1 原始数据：油用牡丹PEPC基因的克隆及表达分析》

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《油用牡丹PEPC基因的克隆及表达分析》

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采用RNAprep Pure Plant Kit（Tiangen公司）提取组织材料的总RNA，其中将油用牡丹叶片的总RNA利用M-MLV反转录酶（TaKaRa公司）反转录为cDNA；根据NCBI已登录的植物PEPC基因序列设计1对简并引物RT-F和RT-R（表1），PCR扩增PEPC基因的保守序列，预期1959 bp；扩增体系为20μL，含10×buffer 2.0 mL，每条引物0.5μmol·L-1，dNTP 600·L-1，TaqDNA聚合酶1 U，cDNA模板1000～2000 ng。PCR扩增程序为：95℃变性5 min；95℃50 s，56℃50 s，72℃2 min，35个循环；72℃；延伸10 min。凝胶回收目的片段，连接到pGEM-T easy载体上，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行测序。根据得到的保守序列，分别设计1对5′端特异引物和1对3′端特异引物（表1），采用SMARTTMRACE Amplification kit(Clontech）进行扩增，凝胶回收扩增产物，克隆到pGEM-T easy载体上，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，分别进行测序。将保守片段、5′端和3′端序列拼接得到油用牡丹PaPEPC2基因的全长。根据拼接的PaPEPC2基因全长序列，在其编码区设计1对引物ORF-F和ORF-R（表1），进行开放阅读框（ORF）区域的PCR扩增，扩增体系和程序同前，对开放阅读框（ORF）序列进行测序和验证。