《表1 q RT-PCR扩增特异引物》

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《基于转录组测序初步揭示天麻生长代谢的分子机制》

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为了验证转录组数据中基因差异表达的正确性，选取转录组基因文库内与生长代谢过程中氮代谢相关的谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）、天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）、谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）、精氨酸酶（arginase，Argase）；碳代谢相关的蔗糖合成酶（sucrose synthase，Su Sy）、可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase，SSS）、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）、淀粉酶（amylase，AMS）和与能量代谢相关的丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、己糖激酶（hexokinase，HK）、丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）、苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）、ATP酶（adenosine triphosphatase，ATPase)14个具有代表性的基因，用Primer 6设计引物，以β-actin作为内参基因进行q RT-PCR相对表达分析[16]，根据其c DNA片段设计特异性引物（表1）。提取RNA后，用Hi Script II 1st Strand c DNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录。将反转录产物稀释10倍，用Cham QTM Universal SYBR?q PCR Master Mix做荧光定量。荧光定量在20μL体系含有10μL 2×Cham QTM Universal SYBR q PCR Master Mix，2μL c DNA模板和0.4μL每种基因特异性引物的反应混合物中进行。最后使用CFX96TM Real-Time System及其相对定量软件进行2次生物重复3次技术重复。反应参数为95℃、30 s，并以95℃、10 s，58℃、30 s循环40次。将c DNA文库分别标准化为参考基因β-actin。通过2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。