《表2 苹果和梨的特异性引物及通用引物序列》

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《苹果和梨远缘杂种后代的鉴定》

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对苹果'金冠'基因组序列与西洋梨（Pyrus communis）'巴梨'基因组序列进行全局比对，提取苹果基因组序列无法比对上西洋梨的序列、以及西洋梨基因组序列无法比对上苹果的序列，对各自提取出来的特异序列进行过滤，选取特定序列长度为100～500 bp序列，将提取出来的特异序列分别比对到苹果和西洋梨基因组上验证其特异性。将苹果的特异序列比对到西洋梨基因组上，如果能比对上，则删除；再比对到苹果基因组上，若不是唯一匹配，则删除；同理，西洋梨的特异序列也执行相同删选。最终得到苹果和西洋梨的高度可信的特异序列，并设计特异引物。在获得的苹果与梨基因组的特异序列中，选取100～250 bp大小的特异片段，使用Primer Premier 5设计特异引物，随后进行PCR扩增，同时扩增杂交父母本，并设置对照组。本研究使用通用引物扩增父母本作对照，当通用引物均可扩增出条带，而特异性引物只能扩增出相应物种的条带时，表明引物特异性真实可信。同时，筛选出只在父母本的苹果或梨中能扩增出条带的引物，即为特异性引物，重复至少3次，以确保引物特异性。研究设计的96对引物，最终筛选出6对分布于不同染色体上的梨和苹果的属间特异性引物（表2），其中3对特异性引物来自梨，3对特异性引物来自苹果。引物均由南京寿德生物技术有限公司合成。