《表2 西花蓟马品系特异性引物序列及扩增产物》

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《基于种特异性COI标记的西花蓟马温室品系和羽扇豆品系一步双重快速鉴定技术》

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DNAMAN (DNAMAN Version 9）比对分析显示，西花蓟马两个品系的碱基序列相似度为96.67%，碱基差异位点19个。以本研究获得的其他14种蓟马以及数据库中已公开的蓟马COI基因序列（包括西花蓟马所有单倍型）为参照，在两个品系所有单倍型碱基序列相似度比较高的区段设计通用上游引物和通用下游引物各1条；然后，在两个品系所有单倍型碱基序列差异位点比较集中且差异位点在同一品系不同单倍型间较保守的区段，分别靶向温室品系和羽扇豆品系，设计6条品系特异性上游引物和3条品系特异性下游引物。即品系通用引物共计2条，其中品系通用上游引物1条，品系通用下游引物1条，分别命名为TF6和TR3。品系特异性引物共计18条，其中温室品系特异性上游引物6条、下游引物3条，分别命名为GF1-GF6和GR1-GR3；羽扇豆品系特异性上游引物6条、下游引物3条，分别命名为LF1-LF6和LR1-LR3；并据此构建一步双重PCR反应体系。体系构建时引物组合方式为，1条通用上游引物与2条特异性下游引物（温室品系和羽扇豆品系各1条）或1条通用下游引物与2条特异性上游引物（温室品系和羽扇豆品系各1条）组合，共计获得组合45种。其中30种组合对两个品系的扩增片段大小基本一致，其混合扩增产物无法在凝胶电泳上有效分离，不符合一步双重PCR快速检测的基本要求[38]，予以舍弃。对其余15种引物组合进行品系特异性预实验验证和引物优化（基于特异性引物设计中GC含量需>40%的原则，进行AT→GC碱基转换。优化后品系特异性下游引物，温室品系命名为GR32，羽扇豆品系命名为LR12；优化后品系特异性上游引物，温室品系命名为GF62，羽扇豆品系命名为LF52）以及再验证，对优化后依然不能进行品系特异性扩增的引物组合予以舍弃，最终确定TF6/GR32/LR12为西花蓟马品系特异性一步双重PCR检测的最佳引物组合，其对温室品系和羽扇豆品系的特异性扩增片段大小分别为362和541 bp（表2）。然后，以该组合引物为靶标进行引物比例和退火温度优化。