《表2 目的基因的引物序列》

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《RIPK3在磨损颗粒激活巨噬细胞PRRs/NLRP3信号通路引起人工关节无菌性松动中的作用机制》

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Real-time PCR:提取“方法1.4-刺激方法1”中不同时间点的RNA样品.检测目的基因为:RIPK3，NLRP3以及IL-1β.引物及内参的PCR序列如表2所示.将提取好的RNA样品稀释至100 ng/μL，构建逆转录体系:10μL样品，4μL逆转录试剂Master-MiX，6μL DEPC水、震荡混匀.程序设置:（ⅰ） 37℃，15 min；（ⅱ） 85℃，5 s；（ⅲ） 4℃保持，将体系置于PCR仪，开启上述程序，获得complementary DNA（cDNA），保存于-20℃.构建Real-time PCR上样体系:7μL DEPC水；10μL SYBR Premix Ex Taq II；2μL cDNA；1μL引物，震荡混匀.设置2个副孔.上机进行基因扩增.使用2步法扩增:（ⅰ）94℃，30 s；（ⅱ）扩增95℃，5 s，60℃，20 s，一共进行40个循环.数据分析:使用LC480系统进行分析.