《表2 甲基化特异性聚合酶链反应引物序列》

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《肝细胞癌患者血清中SOX1和VIM启动子的甲基化检测及其临床意义》

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采用EpiTect Bisulfite Kit试剂盒，根据试剂盒说明书对DNA进行相关操作。取血清DNA 2μg加入4 mol/L NaOH，调整DNA终浓度为0.2 mol/L，于37℃变性10 min。加入30 mol/L NaHSO3，于50℃水浴16 h，经DNA纯化试剂盒修饰后，于室温下加入4 mol/L NaOH，调整DNA终浓度为0.3 mol/L，静置20 min脱硫。加入1/10体积乙酸钠和冰乙醇使DNA沉淀，干燥后加入TE（pH=8.0）溶解。将修饰的DNA作为甲基化特异性聚合酶链反应（methylmion specific polymerase chain reaction，MSP）模板，于-20℃储存。11.2.3 MSP MSP引物序列由上海生工生物工程有限公司合成（表2）。采用25μl聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系:Premix Taq 12.5μl，ddH2O 10.5μl，正向引物和反向引物各0.5μl、亚硫酸盐修饰的DNA 1μl。在ABI 7500型PCR仪上进行扩增，第一轮PCR反应条件:95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火40 s，72℃引物延伸40 s，共进行40个循环；72℃延伸10 min。将第一轮PCR产物稀释50倍后，取1μl进行第二轮PCR反应，PCR反应条件:95℃预变性5 min；95℃变性30 s，65℃退火40 s，72℃引物延伸40 s，共进行40个循环；72℃延伸10 min，产物4℃保存。以人HCC细胞系（HepG2细胞，中科院上海细胞库）DNA作为阳性对照（PC），以健康者外周血淋巴细胞DNA作为阴性对照（NC），以H2O代替DNA作为空白对照（Blank）。取7μl PCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶上进行电泳，采用JS-3000凝胶成像系统分析仪采集图像。