《表4 设计的引物和Taq Man探针在不同退火温度下对不同瘰螈物种及饲料物种的特异扩增测试》

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《香港瘰螈eDNA引物和TaqMan探针的设计与确认》

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—.Ct值>40，为阴性结果。—.Ct value>40 as negative result.

尽管设计的引物和探针在序列分析上有着特异性，但在q PCR反应中使用正确的退火温度才是至关重要，因为如果退火温度太低，容易产生非特异性扩增，而温度太高，则可能影响反应的效率，导致不能扩增或非常高的Ct值、非常低的扩增率（Merck 2019，PCR技术指南）。因此，测试q PCR退火温度是验证引物和探针特异性的关键。通过退火温度的梯度测试（表4），只有在63℃的情况下，引物和探针可以特异性扩增所有12个香港瘰螈的DNA，而其他10个近缘瘰螈物种的11个DNA样本和饲料物种的DNA样本都不能扩增。说明本研究的香港瘰螈特异性引物和Taq Man探针最佳退火温度为63℃。