《表2 香港瘰螈特异性引物和Taq Man探针的序列》

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《香港瘰螈eDNA引物和TaqMan探针的设计与确认》

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下游引物中的“R”是兼并碱基，代表“A”或“G”；探针中的“6-FAM”和“BHQ-1”分别代表亚磷酰胺荧光标记和黑洞猝灭剂。

选取动物细胞中DNA拷贝数较多的线粒体细胞色素b(Cyt b）基因作为目标片段（Robin et al.1988）。首先根据Wu等（2010）的引物和PCR扩增方法，扩增11种瘰螈23只个体（表1）的Cyt b基因序列。Cyt b基因的PCR扩增体系为50μl，包括50 ng DNA、5μl10×PCR缓冲液（Fermentas）、2 mmol/LMgCl2、0.25 mmol/L d NTP (Promega）、0.2μmol/L的正向和反向引物（表2）、1.25 UTaq聚合酶（Promega）。PCR热循环条件：95℃下初始变性2 min；35个循环的95℃变性30 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s；最终在72℃下延伸5 min。以添加无核酸酶的水作为阴性对照以检测污染。2%琼脂糖凝胶电泳检测Cyt b PCR产物扩增情况。采用BGI Tech BioSolutions Company Limited的ABI 3730XLDNA分析仪（Thermo Fisher Scientific）对上述Cyt b的PCR产物进行双向测序。利用软件BioEdit 7.0.5.3进行拼接、比对并辅以手工校对，得到23个完整Cyt b序列，用于进一步设计特异性引物和探针。