《表1 不同Mn2+浓度的易错PCR反应体系的阳性转化率和氨基酸的突变个数》

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《基于易错PCR的β-甘露聚糖酶体外分子定向进化研究》

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在易错PCR反应体系中，调整d NTP的比例，使d CTP、d TTP的浓度增大到1 mmol/L，以促进碱基错配的倾向性．此外，在易错PCR反应体系中分别加入浓度梯度为0 mmol/L，0.01 mmol/L，0.05 mmol/L，0.10 mmol/L，0.15 mmol/L，0.20 mmol/L的Mn Cl2，以得到不同突变频率的文库．用不同Mn2+浓度的易错PCR扩增产物构建表达载体，分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，从突变文库中的每个Mn2+浓度中随机挑取10—20个克隆子进行菌落PCR，检测其阳性转化率；再从中各挑选3个阳性克隆子进行测序．在易错PCR突变文库的建立中，要考虑的重要因素是突变频率的控制，一般来说，突变基因控制在1—5个碱基，对应的氨基酸突变数为1.0～2.0个比较合理．不同Mn2+浓度的易错PCR反应体系的阳性转化率和氨基酸的突变个数如表1所示．由表1可知，当添加Mn2+的浓度为0.01 mmol/L时，阳性转化率最高，达到80.0%，且氨基酸的突变个数为2.0个，符合易错PCR突变文库的一般构建原则．