《表3 研究circRNA翻译常用的实验方法》

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《环状RNA翻译能力研究进展》

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利用生物信息学预测工具对circRNA序列进行预测分析后，需要从多方面对circRNA翻译能力进行功能验证：（1）核糖体印记与深度测序技术筛选结合有核糖体的circRNA。被核糖体包裹的RNA片段不易被Rnase降解，对该部分片段进行测序后，利用CircCode将片段序列信息与circRNA序列信息进行比对，筛选出结合有核糖体的circRNA[59，60]。（2）体外circRNA的ORF翻译能力验证。构建含有circRNA的ORF和Flag标签的载体，将载体转入体外转录翻译系统，利用Flag抗体检测有无Flag融合蛋白生成，验证ORF是否可以在体外编码。（3）细胞内circRNA的翻译能力验证。在circRNA的ORF终止密码子前插入Flag标签，构建含有Flag标签的circ RNA过表达载体，转染细胞后，利用Flag抗体检测有无融合蛋白的生成或利用抗Flag标签蛋白的免疫荧光探针进行检测。（4）根据ORF理论蛋白产物序列设计特异性抗体，通过免疫组化或Western Blot进一步检测circRNA是否在体内进行翻译，后续通过免疫沉淀并结合质谱分析验证产物序列是否与理论蛋白序列一致[12，61]。（5）验证circRNA与翻译起始因子的相互作用。利用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）和蛋白质体外结合实验（RNA pull-down）双向验证circRNA与IRES介导翻译相关的eIF4G2和ITAF（IRES trans-acting factors）的相互作用或与m6A介导翻译相关的YTHDF1/2/3的相互作用[62，63]。（6）验证特定刺激或蛋白对circRNA翻译的影响，例如对细胞进行热应激或饥饿处理，以及对eIF4E、4E-BP、FOXO（forkhead box O）、FTO（fat mass and obesity associated）和METTL3/14等蛋白进行过表达或敲低处理，检测circRNA的蛋白产物是否受到影响[11～14]。circRNA翻译功能验证中常用的实验方法如表3。