《表1 Etk sg RNA序列》

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《Etk敲除及过表达细胞株构建并探讨Etk对细胞增殖的影响》

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实验室利用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除实验，成功建立了完整的实验流程[12，13]。在sg RNA设计网站chopchop（https://chopchop.cbu.uib.no/）输入Etk的基因信息，选择基因敲除功能。选取3条网站评分最高的针对Etk的sg RNA序列，序列见表1。在sg RNA序列两端分别加入BsmBⅠ的酶切位点产生粘性末端，将设计序列送至公司合成。将合成的双链sg RNA退火。55℃水浴情况下利用BsmBⅠ核酸限制酶酶切LentiCRISPR V2载体3小时产生与sg RNA相同的粘性末端；将退火产物与酶切后的载体混合，37℃利用T4 DNA连接酶反应1小时。将连接产物转化到感受态细胞Stbl3后培养在氨苄抗性的LB培养板中，培养12小时后挑取单克隆菌落进行基因测序。选取测序正确序列，菌液大摇提取质粒。