《表2 本实验中所用引物：牙鲆变态中甲状腺激素调控的靶基因》

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《牙鲆变态中甲状腺激素调控的靶基因》

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注:F代表上游引物；R代表下游引物.

对筛选所得的4个候选靶基因进行牙鲆不同组织及变态发育期的相对定量分析，4个靶基因分别是frizzled-3-like、TBC1结构域激酶（TBC1 domain containing kinase，tbck）、氨酰tRNA合成酶复合多功能相互作用蛋白1（aminoacyl tRNA synthetase complex interacting multifunctional protein 1，aimp1）和MYC相关因子X（MYC associated factor X，max）。使用Primer Premier 5.0设计定量引物（表2），利用TaKaRa公司的2×TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）定量试剂在CFX96 TouchTM RealTime PCR Detection System（Bio-Rad，美国）上进行双标准曲线法（以18S rRNA为内参基因）定量。反应体系如下:2×TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）10μL、cDNA 1μL、上下游引物各0.4μL、ddH2O 8.2μL。qPCR程序采用两步法:94℃预变性30 s；94℃变性15 s，60℃退火30 s，40个循环，然后进行熔解曲线扩增。每个样品设置3个生物学重复和2个技术重复，定量数据采用2–ΔΔCt的方法分析，数值采用平均值±标准误（x±SE）表示（n=3）。通过SPSS Statistics 23软件中的单因素方差分析（one-way ANOVA）进行不同样品之间的差异分析，使用Dunnett’s多重比较进行数据差异性检验，当P<0.05时差异显著。采用SigmaPlot 14软件进行作图分析。