《表2 通过电喷雾四极杆联用二级质谱鉴定酪蛋白消化产物中肽组分》

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《酪蛋白体外消化过程中DPP-IV抑制活性的变化规律及其机制分析》

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注：a.BIOPEP数据库中是否已报道的DPP-IV抑制活性；z.电荷数；Y.已报道，N.未报道；ND.无。

为了进一步阐述酪蛋白在消化过程中DPP-IV抑制活性变化的内在机制，采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS对酪蛋白消化后释放的肽段进行序列解析，并分析具有DPP-IV抑制肽典型结构特征的肽段变化规律，主要包括Xaa-Pro-、Xaa-Ala-及Trp-Xaa-等结构特征。本实验仅对鉴定结果中48条满足具有3～10个氨基酸残基的寡肽序列进行分析，除去25条二肽（已很多研究）及8条10肽以上序列（潜力低），结果如图3及图4A所示。酪蛋白在胃蛋白酶消化阶段共释放出25条具有DPP-IV抑制肽典型结构特征的肽段，胰酶消化阶段释放48条特征肽段，数量上将近达到胃消化的2倍，与其消化产物DPP-IV抑制活性变化规律一致，进一步说明其DPP-IV抑制活性可能与其特征肽的释放有关。LC-MS/MS鉴定消化4 h产物分类结果如图4B所示，对DPP-IV抑制肽典型结构特征分类分析，Xaa-Pro-占66%、Xaa-Ala-占32%、Trp-Xaa-仅占2%，即推测酪蛋白消化产物中DPP-IV抑制肽主要是结构特征为Xaa-Pro-的序列。Nongonierma等[11]研究乳分离蛋白消化产物中DPP-IV抑制肽的定量构效关系，而探索结果表明乳分离蛋白消化产物中DPP-IV抑制肽大多也为Xaa-Pro-样肽。表2呈现了这48条具有DPP-IV抑制肽典型结构特征的序列及其相关蛋白来源信息。这些肽来源于αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白4种亚基，其中包括19条目标肽来源于αS1-酪蛋白，14条目标肽来自κ-酪蛋白，基本各占总数的1/3左右，表明这两种亚基序列可以释放更多符合DPP-IV抑制肽典型特征结构。Iwona等[33]利用计算机分析预测得出κ-酪蛋白是良好的DPP-IV抑制肽食物来源，其中目前效力最高的IPI亦来自于κ-酪蛋白，进一步验证本实验结果，但αS1-酪蛋白作为DPP-IV抑制肽的潜在来源还未受到相关具体研究。对这些鉴定得出的肽采用BIOPEP[34](http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）检索已报道DPP-IV抑制肽对比发现，有6条已被报道，分别是IPI（半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为7.40μmol/L）、YPVEPF(IC50为124.70μmol/L）、GPFPILV(IC50为163.70μmol/L）、V P L G T Q(I C5 0为22.80μmol/L）、VPL(IC5 0为15.80μmol/L）、HPIK(IC50为108.00μmol/L），主要来源于αS1-酪蛋白、β-酪蛋白及κ-酪蛋白，表明酪蛋白经体外消化可产生很多较强DPP-IV抑制活性潜力肽段。此外，消化产物中还含有很多文献中尚未报道，但含量较高且具有DPP-IV抑制活性潜力肽段，如VAPFPEVFG、GPFPI、YPELF、SPAQI、NAVPITPT，有待进一步合成验证活性强弱，为开发新的有效降糖物质提供参考。结合图5热图分析消化过程中特征肽含量（由色谱峰面积表示）变化规律发现，胃蛋白酶消化肽段特征大多为含有3～9个氨基酸残基的较长肽，且1～2 h期间，5肽以下短肽释放含量逐渐增加，胃蛋白酶进一步酶切过程导致，但体外抑制活性变化不大，推断这些增加的短肽可能并非完全为竞争性抑制作用[35]。而反观胰酶消化阶段，特征肽结构特征基本为2～7肽较短肽，且胰酶与胃蛋白酶阶段相比较，能释放更多特征肽，且包含6条已报道具有高活性的抑制肽。因此无论从前期直观的特征肽数量上还是各潜在高活性特征肽含量上胰酶消化产物与胃蛋白酶消化产物相较呈增加趋势，能很好地解释前期体外活性评价结果。