《表1 扩增柑橘黑斑病菌β-tubulin基因部分序列的引物信息》

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《柑橘黑斑病菌与柚黑斑病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性及其分子机制》

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利用浙江大学生物技术研究所李红叶教授实验室已测序完成的柑橘黑斑病菌基因组与柚黑斑病菌基因组，将近似种柑橘绿霉病菌（Penicillium digitatum）的β-微管蛋白基因（Pd RUB2，GenBank登录号：D78154）作为参考序列，进行本地比对（local blast）后得到柚黑斑病菌的β-微管蛋白基因全长。利用在线网站（http://www.ebi.ac.uk/interpro）对β-微管蛋白基因进行注释，找到第198与200位氨基酸的位置，取该位置上游400 bp和下游400 bp的基因序列，利用美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）在线设计引物网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计涵盖第198/200位密码子的引物PA-bT-F/R（表1）。鉴于柚黑斑病菌与柑橘黑斑病菌的β-微管蛋白基因的相似度极高，故柚黑斑病菌β-微管蛋白基因也采用同样的引物进行扩增。引物在杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，并根据说明书稀释至10μmol/L后于-20℃条件下保存，备用。将引物存储液稀释10倍后用于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。