《表1 p38MAPK mRNA实时荧光定量PCR检测引物设计》

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《隔药灸对克罗恩病大鼠结肠p38MAPK、ERK1/2及c-fos调节作用的研究》

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采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测，主要步骤包括：（1）组织总RNA的抽提；（2）总RNA中DNA的消除：DNase I 1μL；10×DNase I Buffer 1μL；总RNA≦1 ng；DEPC-H2O nμL。（3）逆转录cDNA:RNA-Primer Mix 12μL；5×RT Reaction Buffer5μL；25 m Md NTPs 1μL；25 U·μL-1RNase Inhibitor 1μL；200 U·μL-1M-MLV Rtase 1μL；Oligo（dt）18 1μL；ddH2O（DNase-free）4μL。PCR扩增：SYBR Green Mix 12.5μL；Primer F 0.5μL；Primer R 0.5μL；ddH2O9.5μL；cDNA模板2μL。4Real-time PCR扩增。扩增条件：95°C，10 min(95°C，15 Sec；60°C，45 Sec）×40；95°C，15 Sec；60°C，1 min；95°C，15 Sec；60°C，15 Sec。记录Ct值，以GAPDH作为内参，蛋白引物设计见表1。通过2-△Ct法计算目的蛋白mRNA的相对表达水平。