《表1 谷氨酸棒杆菌中CRISPR/Cas编辑技术与MACBETH技术的比较》

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《谷氨酸棒杆菌碱基编辑的条件优化》

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碱基编辑技术是近两年发展起来的新型基因组编辑技术，它结合了CRISPR/Cas系统的定位功能与碱基脱氨酶的编辑功能，可以实现在特定位点的碱基替换。相比较于CRISPR/Cas介导的基因组编辑，碱基编辑技术不产生双链DNA断裂（Double-stranded DNA break，DSB），不需要外源模板且不依赖于宿主的同源重组修复，能够实现原核生物多位点编辑，极大地丰富了原核生物的基因组编辑[1]。David Liu研究团队率先将鼠源胞嘧啶脱氨酶APOBEC1与d/nCas9蛋白进行融合，开发了碱基编辑工具BE（Base editor），实现了在哺乳动物细胞中胞嘧啶（Cytosine，C）到胸腺嘧啶（Thymine，T）的单碱基转换[2]；与此同时，Akihiko Kondo研究团队则采用七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶PmCDA1与d/nCas9蛋白进行结合，开发了适用于酵母与哺乳动物细胞的碱基编辑工具Target-AID（Activation-induced cytidine deaminase）[3]。随后多个实验室分别在不同的动植物和微生物中进行了碱基编辑系统的开发与优化[4-7]。之前的研究工作中，本研究团队已在重要的工业模式菌株谷氨酸棒杆菌中首次开发了一种多元自动化的碱基编辑方法MACBETH（Multiplex automated Corynebacterium glutamicum base editing method），实现在C.glutamicum基因组靶标位点C到T的转化[8]。MACBETH技术与谷氨酸棒杆菌中已建立的基于CRISPR/Cas9或Cpf1的基因组编辑技术[9-10]相比，具有诸多优势（表1），不仅高效、简便、易于高通量操作，还可以实现2个或3个靶基因的同时编辑，同时，MACBETH技术实现了从质粒构建、基因组编辑、获取正确突变株和表型验证的全流程自动化操作。