《表1 本实验所用引物序列》

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《杂交石斑鱼干扰素调节因子3(IRF3)基因的克隆及表达分析》

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从本实验室已构建的转录组文库中筛选出注释为IRF3的unigene。经Blast比对验证后，设计特异性引物用于中间片段和全长序列的扩增（表1），采用IRF3-F1与IRF3-R1，IRF3-F2与IRF3-R2为引物扩增中间片段，测序、拼接，成功验证了中间片段，根据已知片段各设计两条5'/3'RACE引物（GSP3'-F1/F2和GSP5'-R1/R2，表1）。运用巢式PCR技术获取5'和3'末端序列，首先以GSP3'-F1和Long primer、GSP5'-F1和Long primer引物进行第一次扩增，引物GSP3'F2和Short primer、GSP5'-F2和Short primer进行第二次扩增，反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用全式金胶回收试剂盒回收目的条带，并将片段导入到pMD-18vector中，再转化到DH5α感受态细胞中37℃培养16 h，挑取3个单克隆菌落送上海生物工程有限公司测序。