《表1 引物列表：N-糖基化对黑曲霉AnLPMO15g与纤维素酶协同作用的影响》

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《N-糖基化对黑曲霉AnLPMO15g与纤维素酶协同作用的影响》

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利用定点突变试剂盒将N-糖基化对应位点上的天冬酰胺Asn（AAT或AAC）突变为中性的谷氨酰胺Gln（CAA），在相应位点设计引入突变碱基CAA的上下游引物。所用引物如表1所示。用An15g-F分别和N151-R，N334-R，N385-R扩增出3个包含突变位点基因的上部分，再用An15g-R分别和N151-F，N334-F，N385-F扩增出3个包含突变位点基因的下部分。PCR体系组成为：cDNA 1μL、上游引物An15g-F0.5μL、下游引物An15g-R 0.5μL、2×Pyrobest Mix 10μL，去离子水加至总量为20μL。PCR扩增程序为：94℃，10 min；94℃，5 min，55℃，30 s，72℃，70 s，共30个循环；72℃，7 min；扩增完毕后4℃保存。琼脂糖凝胶电泳来验证扩增结果，将正确的条带用胶回收试剂盒进行回收。用融合PCR的方法先按表2配制一轮PCR的无引物体系，按上述PCR程序扩增10个循环初步形成全长片段，然后取扩增产物为模板，按表2配制二轮PCR的体系，按上述PCR程序扩增30个循环，从而获得分别包含3个突变位点的目的基因，琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果。将正确的条带用胶回收试剂盒进行回收并保存于-20℃冰箱用于下一步利用。