《表1 Ⅱ型胶原、聚糖蛋白、内参基因的引物序列》

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《椎间隙感染后持续腰背痛的机制研究》

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样品体积约1 mL室温放置5 min，加入0.2 mL的氯仿，剧烈摇晃15 s，室温放置5 min，4℃，12 000 g（r=6.3 cm）离心15 min；离心后的液体分成三层，上层是无色的水相，将上层0.5 mL转移到另一干净的EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀后静置10 min，然后4℃12 000 g（r=6.3 cm）离心15 min；加入0.5 mL75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃7500 r/min（r=6.3 cm）离心5 min，室温干燥RNA沉淀5～10 min，加入无RNase水50μL溶解RNA，用枪头反复吹打几次，55℃溶解10 min。RNA先用DNA酶处理，去除RNA中含有的基因组DNA，37℃孵育30 min，之后加入1μL终止液，然后在65℃孵育5 min，终止反应。纯化后的RNA进行cDNA模板第一链的合成。反转录第一链合成的反应首先将纯化后的RNA 8μL、随机引物1μL和超纯水1μL，65℃孵育5 min，迅速取出放冰上，静置5 min。然后分别加入反转录缓冲体系5×Buffer4μL、MgCl23μL、RNA酶抑制剂0.2μL、dNTP Mix1μL、反转录酶1μL和超纯水0.8μL。25℃孵育5 min，42℃反应1 h，70℃10 min，之后结束程序。qPCR反应条件:95℃2 min，95℃10 s、55℃30 s、60℃30 s共40个循环，熔解曲线生成2 min。引物序列见表1。