《表1 sgRNA体外切割效率检测》

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《利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠》

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取正常小鼠鼠尾组织，加入消化液后65℃作用30 min提取小鼠基因组DNA，具体提取过程按试剂盒说明书进行。以基因组DNA为模板，通过miR223-seq-F:GGCCACCAGAATCTCCAGAC，miR223-seq-R:GCAGTCCATGGCATTTTCACA上、下游引物进行PCR反应扩增底物DNA。纯化后，500 ng的底物DNA中分别加入mir223-TS1、mir223-TS2 sgRNA转录产物和Cas9-NLS蛋白，37℃作用30 min，具体反应体系见表1。然后加入浓度为20 mg/m L蛋白酶K 1μL，37℃作用15 min，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。