《表4 切割效率检测用引物》

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《CRISPR/Cas9介导获得用于分离双峰驼iPSCs的转染细胞系》

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待F2代细胞汇合度达到70%时，按照Lipofentamine 2000转染试剂盒说明书进行转染，按照六孔板每孔4μg切割载体质粒转染细胞。48 h后使用流式细胞仪分选出带绿色荧光的细胞，使用试剂盒提取基因组DNA。使用检测引物T7-F1/T7-R1（表4）扩增目的片段，扩增时72℃延伸时间为30 s，其余条件同1.2.1.1。用T7E1酶切鉴定法来检测3组sgRNA连入后所构建切割载体的切割效率，T7E1酶切体系（19μL）:目的片段（40 ng/μL），5μL；10×NEB buffer 2 2μL；ddH2O，12μL。预处理程序为:95℃，5 min；95~85℃，10 s，-2℃/循环，5 cycle；85~25℃，-0.1℃/循环，600循环；12℃保存。将预处理后的含目的片段的19μL体系，加入1μL T7E1酶，37℃酶切30 min。将酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过对凝胶的扫描图片进行灰度值分析，选取切割效率较高的1组用于后续实验。