《表1 RT-PCR基因及其引物序列》

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《新生大鼠棕色脂肪干细胞心脏细胞分化潜能研究》

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（1） RNA的提取，收集细胞，加入适量裂解液混匀，离心，上清液转入无RNA酶的EP管中；加入等量无水乙醇混匀，转至含Zymo-spinTMIC柱的收集管中，离心；加入RNA prep缓冲液，离心；加入RNA wash缓冲液，离心；IC柱转置于无RNA酶的EP管中，加入无RNA酶和DNA酶的水，离心；分光光度仪上测定RNA含量和纯度。（2）cDNA合成，按说明书配制10μL体系，在无RNA酶的EP管中加入500ng模板RNA，依次加入引物及缓冲液等，补充双蒸水至10uL，吹打混匀，置于PCR仪上。条件设置为:37℃15min，85℃5秒，所获产物即cDNA。（3）RT-PCR反应，按试剂盒操作方法加入cDNA及前后引物，设置PCR反应参数为:预变性95℃4min，循环反应（95℃30s—60℃20s—72℃30s），35个循环，延伸72℃10min。PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定并成像。心肌细胞特异标记物基因表达阳性提示细胞分化为心肌细胞，而CCSs标记物基因表达阳性提示细胞分化为CCSs。（4）荧光定量qPCR反应，按照说明书加入SYBRPremix Ex TaqTMII，模板，前后引物，补充无菌水至20μL。离心后，上机检测。参数设置为:预变性95℃5min。循环反应（40循环）为:95℃10s；55-60℃20s；72℃20s。熔解曲线:95℃15 s；60℃60s；95℃15s。β-actin为内参，对照组或Tgfβ1组中的β-actin表达量为对照。