《表1 RT-PCR检测引物及其序列》

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《miR-375下调YAP1对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响》

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2.研究方法:（1）细胞系与主要试剂。人结直肠癌癌细胞系（HCT116、NCI-H716、HRC-99）及正常结直肠细胞系FHC购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心。RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶购自Gibco公司、双抗（青霉素-链霉素）购自上海碧云天公司；miR-375慢病毒（HIV）购自吉凯基因化学技术有限公司；Lipofectamine 2000Trizol试剂、RT-PCR相关试剂盒均购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自上海东仁化学科技公司；Transwell小室购自美国Corning公司；一抗YAP1兔抗人抗体、二抗辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔Ig G均购自上海碧云天公司。（2）细胞培养及转染。HCT116、NCI-H716、HRC-99和FHC均在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基中37℃、5%CO2进行培养。当细胞融合度大约为80%时，用胰酶消化进行传代。在6孔培养板中接种对数生长期的HCT116细胞，分为实验组（与miR-375慢病毒共同转染的HCT116细胞）、对照组（未转染的HCT116细胞）和空载体组，依据Lipofectamine 2000Trizol试剂盒说明书进行转染。（3） RT-q PCR法检测结直肠癌组织和细胞中miR-375的表达。收集细胞，根据Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，应用Super Script First Strand c DNA Synthesis Kit将其反转录为c DNA，通过7300 Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪，使用Sybr Green 2×PCR Master Mix检测细胞中miR-375的表达。反应条件:95℃，10s；95℃，15s；60℃退火15 s，进行40个循环。相对表达水平采用2-ΔΔCt进行计算。每份样品重复测量3次。检测引物序列见表1。（4） CCK-8检测细胞增殖能力。转染操作48 h后，收集并调整细胞密度至1×106个/ml。以每孔100μl接种至3块96孔板上，分别在接种后的第1天至第5天，分别加入10μl CCK-8溶液，继续培养。4 h后吸去培养基，放入酶标仪检测450 nm波长处每孔的吸光度（A）值，计算相对增殖活性。（5） Transwell小室实验检测细胞迁移能力。将Transwell侵袭小室置入24孔板中，在Transwell小室的下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，收集转染后的结直肠癌细胞重悬，加入200μl重悬液（共5×104个细胞）到Transwell小室的上室；培养24 h后取出小室，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗小室，用棉签轻轻拭去上室细胞，4%甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色30 min，PBS冲洗3次，显微镜下随机选取6个不同区域，计算每个视野内穿过滤膜的细胞数进行统计学分析。（6） Western blot检测YAP1的表达。使用RIPA缓冲液提取总细胞裂解物，BCA法测定总蛋白浓度，在SDS-PAGE凝胶上电泳分离蛋白，结束后转移至聚偏二氟乙烯膜上，以5%脱脂奶粉室温封闭2 h。加入YAP1一抗（1:1 000），4℃下孵育过夜。充分漂洗后，加入HRP标记的羊兔Ig G二抗（1:5 000），室温下孵育2 h。将结果用扫描仪输入计算机，用Scion Image4.02软件进行定量分析；去除背景后的加权像素灰度代表蛋白质相对含量；GAPDH作为内参，以保证蛋白质等量上样。实验重复3次。