《表2 RT-PCR检测引物序列》

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《新短肽P17-骨形态发生蛋白2/胶原基质矿化磷灰石材料生物活性的评价》

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培养3，7 d后：（1）提取细胞总RNA：用PBS清洗贴壁细胞后，加入1 mL RNAiso Plus充分溶解5 min。用移液器转移到EP管中，12 000×g离心15 min（4℃），吸上清于新的EP管中。加入三氯甲烷，体积至少为加入RNAiso Plus的1/5，静置10 min。12 000×g离心15 min（4℃），吸上清于新的EP管中。加入吸取上清等体积的异丙醇，静置10 min。12 000×g离心15 min（4℃），倒掉上清，加入预冷体积分数75%乙醇1 mL。7 500×g离心10 min（4℃），倒掉上清，加入体积分数100%乙醇1 mL。7 500×g离心10 min（4℃），倒掉上清，晾干乙醇。加入适量的无RNA酶水，水浴溶解7 min；（2）反转录（10μL体系）：测定好RNA浓度后用无RNA酶水取适量稀释成60 mg/L。配制Realtime特异性反转录体系，并用水补到5μL。离心后放入机器内，37℃15 min，85℃5 s，4℃冷却。-20℃长期保存；（3）RT-PCR染料法（20μL体系）：将反转好的cDNA按每孔0.2μL稀释到5μL水中。配制Realtime反应体系，其中加入上下游引物（表2）各0.6μL，使其终浓度达到0.3μmol/L。加15μL反应体系入光学96孔板，然后加入配好的cDNA，加盖光学封口膜。离心后放入定量PCR仪按以下条件进行95℃30 s，1个循环；95℃5 s；60℃30 s，40个循环测定荧光信号。RT-PCR的扩增曲线和融解曲线，采用7000 system sds software软件程序进行分析，通过扩增曲线与阈值线的交点得到各组样品目的基因和参比基因（GAPDH）的Ct值，计算以参比基因为标准的相对表达量?Ct。按照公式?Ct=Ctgene-Ctreference，Ratio=2-??Ct计算碱性磷酸酶的相对表达，绘制图表。