《表1 引物序列：土壤杆菌-毕赤酵母耦合培养直接生产热凝胶低聚糖》

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《土壤杆菌-毕赤酵母耦合培养直接生产热凝胶低聚糖》

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密码子优化后的内切-β-1，3-葡聚糖酶BGN13.1a片段由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，p GAP和pFLD基因序列以P.pastoris GS115基因组DNA为模板，利用引物（表1）通过扩增获得。目的基因BGN13.1a通过双酶切法插入质粒p PIC9K中，得到重组质粒pPIC9K-BGN13.1a，将p AOX1序列替换为p GAP和pFLD序列，得到重组质粒pGAP9K-BGN13.1a和pFLD9K-BGN13.1a，通过酶切、菌落PCR（聚合酶链式反应）、测序进行验证。测序正确的重组质粒经Sal I线性化后于2.5 k V电压下电转化5 ms至P.pastoris GS115（步骤包括引物和酶切位点选择，见表1及图1），涂布MD平板。