《表1 PCR引物信息：鲤鱼c型溶菌酶在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性》

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《鲤鱼c型溶菌酶在毕赤酵母中的重组表达及其抑菌活性》

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斜体指示XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点；下划线指示Kex 2信号肽酶切位点；粗体指示6×His标签；阴影指示甘氨酸密码子

用于下述PCR扩增的引物如表1所示。以实验室已有的鲤鱼（Cyprinus carpio）鳃第一链cDNA为模板（李雯，陶妍，2017），参考鲤鱼c型溶菌酶基因序列（GenBank No.AB027305.1）设计引物CLF/R1，对编码鲤鱼c型溶菌酶成熟肽的cDNA进行PCR扩增。PCR反应体系：cDNA 0.2μL、上下游引物（10μmol/L）各0.8μL、dNTP（2.5 mmol/L）1.6μL、10×PCR Buffer 2.0μL、Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.2μL，以ddH2O补足至20μL；PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃40 s、53.9℃30 s、72℃60s，30个循环；72℃5 min。将扩增片段与p MD19-T连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选择阳性克隆交由上海生工生物工程有限公司测序。以上述片段为模板、CLF/R2为引物，通过PCR对其3'端添加XbaⅠ酶切位点、将近5'端的赖氨酸密码子替换为甘氨酸密码子，PCR反应体系和条件同上（退火温度为57.8℃）；以此片段为模板、CLF3和CLR2为引物，通过PCR对其5'端添加6×His标签，PCR反应体系和条件同上（退火温度为53.3℃）；最后以该片段为模板、CLF4和CLR2为引物，经PCR对其5'端添加Kex 2信号肽酶切位点和XhoⅠ酶切位点，PCR反应体系和条件同上（退火温度为57.7℃）。最后获得的目的基因命名为CLYc（common carp ctype lysozyme），与pMD19-T连接后进行DNA测序（同上），获得重组克隆载体pMD19-T-CLYc。