《表1 MSAP分析选择性扩增引物序列》

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《山核桃甲基化敏感扩增多态体系的建立与甲基化初步分析》

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基于洪舟等[19]用于杉木的MSAP分析体系，在山核桃中就酶切连接时间、预扩增产物稀释倍数、选择性扩增的模板DNA用量及PCR退火温度（第1轮）与扩增循环数（第2轮）进行优化，建立适用于山核桃MSAP分析体系。DNA限制性酶切与接头连接采用1步法。在此基础上对酶切连接时间（4，6和8 h）进行实验。因为预扩增与选择性扩增的目的与程序有差异，所以有必要就具体的物种或研究对象，对实验进行一定的优化[25]。在预扩增阶段，参考已有的杉木MSAP分子标记体系[19]以及苹果Malus pumila[26]，脐橙Citrus sinensis[27]等其他经济物种的MSAP反应体系，测试3种不同的预扩增产物稀释倍数（10，20和40倍），同时试验选择性扩增的模板DNA用量（2和4μL）。借鉴三叶木通Akebia trifoliata的MSAP反应体系[28]，对选择性扩增程序（94℃变性2 min:第1轮PCR 94℃30 s，65℃30 s，每个循环递减0.7℃，72℃1 min，共13个循环；第2轮PCR 94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min；最后72℃延伸10 min）中第2轮PCR的循环数（20，25和30次）及第1轮PCR中退火温度的递减幅度（每循环分别降低0.7，1.0和1.3℃）进行优化。以上试验内容按序进行，待前1个参数优化后便固定下来进行后1个参数的优化。选扩产物用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测。选扩产物电泳检测有扩增产物，且条带清晰，则进行96对引物组合（表1）的筛选，用体积分数为6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并对胶进行常规银染。