《表1 荧光定量微生物引物序列》

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《不同类型猪舍内气溶胶中致病菌数量和内毒素水平的比较研究》

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采用UltraClean Soil DNA Isolation Kit提取AGI-30采集的猪舍气溶胶终溶液（50 mL，总空气量为1 200 L）中的总DNA。所有提取步骤按照试剂盒说明书进行。总DNA的浓度和纯度采用NanoDrop ND-1000测定。样品总DNA的质量采用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。参照V.Létourneau等[2]的方法采用RT-qPCR检测32个猪舍气溶胶样品中Campylobacter、C.perfringens、Enterococcus和E.coli的丰度，引物见表1。以从DSMZ公司购买的空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、C.perfringens、Enterococcus caccae和E.coli构建标准质粒DNA。采用10倍稀释标准质粒DNA建立弯曲杆菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌、肠球菌和大肠埃希菌的标准曲线。PCR反应体系为10μL，包括2μL DNA，上下游引物各0.25μL（1μmol/L），5μL 2×KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix和3.5μL无核酸酶水。反应条件为:95℃15min，40个循环变性/退火/延伸（95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s）。荧光定量反应在ABI7600仪器上进行。将样品中某一致病菌的Cq值代入到相应的标准曲线中，并根据总通气量计算每立方米猪舍空气中致病菌的拷贝数。