《表1 文中所用引物：固氮菌(Ensifer meliloti 1021)降解苯甲腈及其代谢酶的基因克隆和表达》

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《固氮菌(Ensifer meliloti 1021)降解苯甲腈及其代谢酶的基因克隆和表达》

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下划线部分为酶切位点序列，酶切位点前序列为pET28a载体同源序列。

PCR扩增所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1，引物上含EcoRI和Xho I限制性酶切位点。PCR体系为10×LA缓冲液2μL，25mmol·L-1MgCl22μL，dNTP 2μL，En.meliloti 1021基因组DNA 2μL，LA taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O 11μL，上下游引物分别0.4μL；扩增程序如下:95℃预变性5 min，95℃变性5 s，退火温度58℃反应40 s，72℃延伸2 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。克隆的目的基因片段用EcoRI和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳验证，然后用ClonExpressII一步克隆试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）将目的片段连入含相同酶切位点的pET28a质粒。E.coli Rosetta（DE3）用氯化钙处理成感受态[15]。根据文献[16]报道的方法在E.coli Rosetta（DE3）中进行En.meliloti 1021腈水合酶和酰胺酶的质粒构建。挑取阳性克隆，送南京斯普金生物有限公司测序。