《表1 中华绒螯蟹MIH基因编码区SNPs基因分型所用引物及限制性内切酶》

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《中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因单核苷酸多态与性早熟的关联性分析》

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注:下划线表示PCR扩增引入的错配位点。

随机挑选30只蟹种并提取每个样本的基因组DNA，根据中华绒螯蟹MIH基因序列信息（AY310313）设计引物扩增外显子区和内含子区（3个外显子及2个内含子），采用PCR产物直接测序筛选区段的SNP位点（引物未列出）。根据得到的SNPs信息，分别设计引物扩增包含不同SNP位点的序列片段（表1）。PCR反应体系为25μL（Vazyme Biotech Co.，Ltd），其中包括2×Taq Master Mix 12.5μL，dNTP（2.5 mM）1μL，正反向引物（10μM）各1μL，ddH2O补足体积至25μL。PCR反应共计30个循环，循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循环结束后于72℃延伸5 min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后于-20℃保存，用于后续酶切反应。