《表1 实时定量RT-PCR引物序列》

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《刚毛柽柳S-腺苷甲硫氨酸合成酶(ThSAMS)基因的克隆及表达分析》

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利用实时荧光定量RT-PCR技术对ThSASM基因的表达进行分析。根据ThSAMS全长cDNA序列设计定量引物（表1），以刚毛柽柳β-actin（FJ618517）、α-tubulin（FJ618518）和β-tubulin（FJ618519）基因作为内参基因，引物序列见表1。利用MJ Opticon实时定量PCR仪（Bio-Rad，Hercules，CA）分析ThSAMS基因的表达模式。实时荧光定量RT-PCR使用全式金的TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒，反应体系为:2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10μL，稀释10倍后的模板cDNA 2μL，上游引物和下游引物（10μmol·L-1）各1μL，加灭菌去离子水补足体积至20μL。反应程序为:94℃预变性30 s；94℃变性12s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，79℃读板1 s，45个循环。待PCR反应结束后，将反应温度以0.5℃·s-1的速度从55℃升到99℃。每个样品重复3次，用2-△△Ct方法进行基因的相对定量分析[20～21]。