《表1 引物序列：水稻中的“伥鬼”:不同表观遗传状态的同一转基因之间的相互作用》

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《水稻中的“伥鬼”:不同表观遗传状态的同一转基因之间的相互作用》

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重亚硫酸盐处理后未甲基化的C变为T，所以将扩增引物中F引物由原参考序列中C设计变为t，R引物将G变为a。

将超表达载体35S启动子分为5′端及3′端，分别长310和370 bp。以重亚硫酸盐处理过的水稻g DNA为模板，对启动子5′端和3′端分别进行巢式PCR。5′端扩增引物为35S-5′-Bis F1/R1 （第1轮PCR引物）和35S-5′-Bis F2/R2 （第2轮PCR引物）（表1），3′端扩增引物为35S-3′-Bis F1/R1 （第1轮PCR引物）和35S-3′-Bis F2/R2 （第2轮PCR引物）（表1）。利用2×Taq Master Mix （Dye Plus）（货号P112-03，Vazyme）进行PCR扩增。第1轮PCR体系总体积设置为10μL，模板量为200 ng，程序设置为:95°C预变性3 min，95°C变性30 s，50°C退火30 s，72°C延伸30 s，重复33个循环；72°C最终延伸5 min。第2轮PCR以3μL第1轮PCR产物为模板，PCR体系为50μL，程序将循环数提高到35，其余条件与第1轮相同。将第2轮PCR扩增的产物纯化后连入p MD19-T中，构建载体过程参照p MDTM19-T Vector Cloning Kit （货号6013，Takara）说明书进行。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞（C502，Vazyme）中，挑取单克隆进行PCR验证。PCR引物为p MDTM19-T Vector Cloning Kit提供的鉴定引物Bca BEST Sequencing Primers （表1），PCR体系仍按照2×Taq Master Mix（Dye Plus）（货号P112-03，Vazyme）说明书进行配制。PCR程序设置为:95°C预变性3 min，95°C变性30 s，55°C退火30 s，72°C延伸30 s，重复35个循环；72°C彻底延伸5 min。对候选单克隆进行测序，将参考序列文件及测序结果文件内序列编辑成fasta格式上传到甲基化分析网站http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl进行甲基化水平的分析。