《表3 克隆实验所用引物Table 3 The primer used in clone》

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《瘤背石磺Os-NMHC的克隆、表达分析以及NMHC进化节点探讨》

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利用软件Primmer5.0设计验证引物Test-F、Test-R（表3），以瘤背石磺背部皮肤c DNA为模板进行PCR扩增反应。使用1.5%琼脂糖凝胶对小于1 000 bp的目的片段进行切胶回收、纯化；大于1 200 bp的扩增片段，使用1%琼脂糖凝胶切胶回收、纯化；将目的片段与p GEM-easy vector载体连接，转化到DH5-α感受态细胞，经蓝白斑筛选和扩大培养后，将阳性克隆菌液送往上海生工生物工程有限公司和上海迈浦生物科技有限公司进行测序，拼接出最大长度。设计20~24 bp，GC含量45%左右的RACE上游引物3&apos；RACE-F1、3&apos；RACE-F2，然后分别以3&apos；outer primmer和3&apos；inner primmer为下游引物，3&apos；RACE-c DNA为模板进行巢式PCR反应，将获得的产物用1%琼脂糖凝胶进行检测、回收、连接、转化、筛选、扩大培养后测序。5&apos；RACE-c DNA为模板，设计下游引物5&apos；RACE-R1、5&apos；RACE-R2，然后分别以5&apos；outer primmer/5&apos；RACE-R1和5&apos；inner primmer/5&apos；RACE-R1为上游引物，按照RACE实验说明书进行巢式PCR，扩增目的片段5&apos；端未知序列。将3次测序成果进行拼接得到c DNA全长序列，根据c DNA序列全长设计特异性引物验证全长序列，通过重测序消除不确定碱基。