《表1 5种立克次体靶基因的选取及重叠引物的设计》

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《2种重叠延伸PCR技术构建5种立克次体融合基因的方法学比较》

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注:下划线部分为与相邻靶基因的互补序列；无下划线部分为靶基因的特异性引物序列。

5对特异性引物合成由上海生工公司完成，片段大小及引物设计序列见表1。将5个靶基因质粒及5对特异性引物分别构建50μL PCR扩增体系进行PCR扩增，体系中各成分含量包括:靶基因质粒模板1μL，10μmol/L上、下游特异性引物各1μL，2×Easy Taq PCR Super Mix25μL，dd H2O补足至50μL。循环参数:96℃5 min；96℃22 s，56℃22 s，72℃25 s，共30个循环；72℃5 min，4℃保存。扩增结束后进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，并通过UVP凝胶成像仪观察是否扩增出相应的5个目的基因。