《表1 PCR检测新埃立克体的16SrRNA基因和groEL基因引物》

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《福建省鼠类携带新埃立克体调查及16S rRNA和groEL基因特征研究》

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groEL基因第一轮扩增采用引物CNM-out1和CNM-out2。扩增体系：Premix Taq酶12.5μl，上、下游引物各0.5μl（10μmol/L），DNA模板3μl，加双蒸水至总体积25μl。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，共循环40次；72℃总延伸5min。第二轮扩增体系：Premix Taq酶12.5μl，上下游引物CNM-in1和CNM-in2各1μl（10μmol/L），第一轮产物0.5μl，反应程序同第一轮PCR。半套式PCR扩增16SrRNA基因第一轮PCR反应体系：Premix Taq酶12.5μl，上、下游引物Eh-out1和Ehout2各0.5μl(10μmol/L），DNA模板5μl，加双蒸水至总体积25μl。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸1min，共循环40次；72℃总延伸5min。第二轮PCR扩增体系：Premix Taq酶12.5μl，上、下游引物Eh-out1和Ehgs2各1μl(10μmol/L），第一轮PCR产物0.5μl，加双蒸水至总体积25μl。除循环次数为35次外，其余反应程序同第一轮PCR反应。首份阳性产物纯化测序后进行序列比对，确定为新埃立克体，其后的检测以此作为阳性对照。同时为避免发生污染，DNA模板的提取、PCR扩增、凝胶电泳均在不同的房间操作，所有扩增均设空白对照和阴性对照。引物信息见表1。