《表3 本研究RT-PCR所用引物》

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《调整葡萄糖转运系统提高大肠杆菌L-苏氨酸产量》

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TWF001Δpts H，Ptrc::Pgal P的构建是以MG1655基因组为模板，以引物gal Pf1/gal Pr1扩增出gal P基因上游片段gal P-U，以引物gal Pf2/gal Pr2扩增出gal P基因上游片段gal P-D，引物Trc-F/Trc-R95℃变性、4℃退火形成trc启动子片段，再通过重叠PCR把上游、trc启动子和下游片段重叠到一起得到gal P的敲入片段trc-gal P。以p Target F为模板，以引物sg RNA-gal P-F/T-sg RNA-R扩增出构建p Target F-gal P的片段，片段经过Dpn I酶消化，T4Pnk激酶磷酸化，T4 DNA连接酶连接后化转到JM109感受态中，构建和扩增质粒，在含50 mg/L壮观霉素的LB平板上生长10 h后，用引物Y-gal P-F/T-sg RNA-R筛选正确的转化子，得到敲除质粒p Target F-gal P。100 ng敲除质粒p Target F-gal P和500 ng敲除片段trc-gal P同时电转入80 u L的TWF001Δpts H/p Cas电转感受态中，在30℃、100 r/min慢摇复苏2 h，涂在含50 mg/L壮观霉素和卡那霉素的LB平板，30℃培养48 h后用引物Trc-F/gal Pr2验证，得到正确敲入的转化子，正确的转化子转接含50 mg/L卡那霉素和0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的LB试管诱导培养去除p Target F-gal P质粒，42℃过夜培养去除p Cas质粒，去除p Target F-gal P和p Cas质粒后分别在含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上进行反筛，确定是否去除质粒成功，最后得到不含质粒的正确敲入trc-gal P基因的突变菌TWF001Δpts H，Ptrc::Pgal P。