《表1 融合片段AN扩增所需引物设计》

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《AN融合抗原制备及其加强BCG免疫效果的研究》

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从https：∥mycobrowser.epfl.ch/中获取结核分枝杆菌H37Rv的基因组信息，设计引物分别对EsxA（Rv3875）、EsxC(Rv3890c）、EsxH(Rv0288）、EsxT(Rv3444c）、EsxN(Rv1793）编码基因进行扩增，PCR反应体系：32μL水，5×buffer10μL，DNA Polymerase 1μL，上下游引物各1μL，4μL dNTPs，2μL H37Rv基因组模板．用AxyPerpTM DNA Gel Extraction Kit试剂盒回收PCR反应产物．回收后的5个DNA片段利用融合PCR的方法顺序连接．为了保证每个抗原表位的天然构象，最大程度提供天然抗原的免疫原性，通过一段9个氨基酸的柔性Linker序列（GGACTAGTACCCCGAGGATCAACAGGA）[19]将5个抗原组分顺次连接，得到片段长度为1 557bp的融合序列AN.PCR扩增AN片段，并在片段两端引入合适酶切位点，通过酶切连接将AN片段连至载体pET-28(a），转化克隆菌株E.coli Trans 5α，经抗性筛选后进行测序验证．