《表2 肠道病毒扩增测序引物》

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《2016-2018河北地区儿童病毒性脑炎流行特征调查》

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选取肠道病毒样品，利用PCR扩增病毒VP1基因序列片段，引物设计参照GenBank和过往文献[11-12]（表2）。采用A-OS/A-OAS引物对肠道病毒A群进行第一轮扩增；A-IS/A-IAS引物对肠道病毒A群进行第二轮扩增。同样，分别采用B-OS/B-OAS、B-IS/B-IAS引物分别对肠道病毒B群进行第一轮和第二轮扩增。第一轮反应液配置：2μl第一轮反应酶混合液，4μl Prime script burffer，4μl RNA模板，1μl PCR Forward Primer，1μl PCR Reverse Primer，ddH2O补足25μl。第一轮反应条件：50℃40min；94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环35次；72℃8min。第二轮反应液配置：2.5μl Ex Taq DNA聚合酶，4μl Mg2+，4μl DNA模板，1μl PCR Forward Primer，1μl PCR Reverse Primer，ddH2O补足25μl。第二轮反应条件：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，循环35次；72℃8min。收集产物，将3μl产物放入电泳仪胶板中，采用含有嗅化乙锭（EB）的1%的琼脂糖凝胶，进行电泳（电压120V，30min）。凝胶采用Universal HoodⅡ凝胶成像分析系统成像，将扩增结果为阳性且清晰的样品进行测序。测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，测序结果由Bio Edit进行矫正。将本次研究中获到的病毒VP1序列与NCBI的BLAST数据库中数据进行对比，若85%氨基酸与数据库中病毒具有同一性则认为是同一血清型。利用软件MEGA6.0对柯萨奇病毒B5绘制种系发生树，采用邻位相连法构建进化树。