《表1 pyk基因PCR扩增用到的引物》

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《牛支原体武威分离株丙酮酸激酶基因的原核表达及其表达产物的功能检测》

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注：下划线处为Bam HⅠ、XhoⅠ酶切位点序列；方框为点突变位点。

参照GenBank中Mb PG45株PK基因（pyk）序列（CP002188.1）设计2对引物（表1），并在pyk-F和pyk-R分别引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位点。采用over-lap PCR扩增pyk基因：以Mb基因组DNA为模板，以引物pyk-F/pyk-Rn扩增A片段，引物pyk-Fn/pyk-R扩增B片段，再以A+B为模板，用引物pyk-F/pyk-R扩增得到pyk基因全长；反应程序为：98℃5 min；98℃45 s，54℃30 s，72℃45 s，30个循环；72℃10 min，PCR产物回收后克隆至pGEM19-T载体，构建重组质粒pGEM-pyk并经酶切鉴定，阳性克隆由金唯智公司测序鉴定。