《表1 Primer sequences and the probes for LDR》

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《Visfatin基因启动子区域的遗传变异与中国北方汉族人群缺血性卒中发病风险研究》

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采用DNA纯化试剂盒（Promega，Madison，USA）提取200μL EDTA抗凝外周血的基因组DNA，并用分光光度法测量DNA纯度，并将DNA样品置于-80℃冰箱中保存。使用聚合酶链反应-连接检测反应（PCR-LDR）方法对基因组DNA进行基因分型。表1列出了用于PCR的引物序列。PCR扩增体系的总体积为10μl，包括1×GC-I缓冲液（Takara），3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L d NTP，1 U热启动Taq聚合酶（Qiagen Inc），1μl基因组DNA和每个对应的1μl引物。循环参数如下:95℃预变性2 min；94℃变性20 s，65℃退火40 s，72℃延伸90 s，共11个循环；在94℃下持续20 s，59℃下持续30 s，72℃下持续90 s，共24个循环；最后在72℃下延伸2 min。LDR的探针在表1中列出。每个PCR产物的连接检测反应的体积为10μl，其中包含1μl 10×连接缓冲液，2μl PCR产物，6μl双蒸馏水，0.4μl每个区分探针和0.25μl Taq DNA连接酶（New England Biolabs，USA）。LDR参数如下:94℃60 s，56℃min，共38个循环。反应后，将5μl LDR反应产物与9μl Hi-Di ROX（Applied Biosystems，USA）及0.5μl的上样缓冲液混合，然后在95℃下变性5 min。最后用ABI Prism 3730XL DNA测序仪（Applied Biosystems，USA）分析混合物。