《表1 桂花HYB1和HYB2基因克隆的引物序列Tab.1 Primer sequences for cloning HYB1and HYB2 genes of Osmanthus fragrans》

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《桂花β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析》

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根据前期浙江农林大学桂花新品种培育课题组已构建的桂花堰虹桂花瓣转录组数据库[8]，从中筛选出与HYB基因相关Unigene序列，设计特异性引物对（表1），以不同品种RNA反转录的cDNA为模板，对桂花HYB1和HYB2基因最大阅读框序列进行PCR扩增。PCR反应体系为RNase-Free ddH2O 28.5μL，LA Taq0.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，PCR Buffer（Mg2+Plus）10μL，dNTP 8μL。PCR反应程序为:95℃5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，循环35次后，72℃10 min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收、纯化，与pMD18-T载体（Takara）连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，经PCR鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。