《表2 T4DNA聚合酶处理反应体系》

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《β-N-乙酰葡萄糖苷内切酶Endo S异源表达及发酵优化》

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以质粒pET30a-endo S为模板，用表1中正反向引物通过PCR扩增endo S基因和pET28a载体。首先用T4 DNA聚合酶消化扩增得到线性载体及目的基因，按表2所示加入反应体系，反应温度22℃，时间45 min。反应结束后，在上述体系中迅速加入1μL dCTP(100μmol/L）混匀终止反应，放置在冰上，加入10μL退火缓冲液（5×），于PCR仪中退火：75℃处理10 min，然后每8秒降低0.1～25℃，退火完成，柱回收。柱回收完成后，限制性内切酶DpnI处理回收片段去除模板质粒，37℃反应1 h，转化预先融化的BL21(DE3）感受态细胞，涂布卡纳抗性平板37℃倒置培养过夜，挑选单菌落进行菌落PCR，最后挑选阳性克隆子送至公司测序，将测序正确的菌株制成甘油菌-80℃保存。