《表1 RT-PCR引物序列》

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《从化地区儿童人冠状病毒流行病学与临床特点的观察》

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按照试剂盒的说明操作，使用QIAamp MiniE-lute Virus Spin（德国QIAGEN）从200μL的喉咙和鼻拭子样本中提取病毒DNA和RNA。使用Thermo Scientific Revert Aid First绞链cDNA合成试剂盒（Thermo，USA）进行病毒RNA的反转录，过程为:25℃5 min，42℃60 min，然后70℃5 min。cDNA可立即用于病毒检测，或保存在-20℃下直至进一步使用。通过标准逆转录PCR（RT-PCR）检测冠状病毒，筛选HCoV和4种（OC43、229E，NL63，HKU1）。TaqMan实时PCR引物和探针（由Invitrogen，Life Technology，上海合成）被设计为结合高度保守的HCoV区域和相应物种，并通过Primer Express软件（3.0版，美国应用生物系统公司）进行分析（用于引物）。每个反应混合物由10μL 2×i Q Supermix反应混合物（Bio-Rad），2μL病毒cDNA，0.5μM正向和反向引物以及0.3μM探针和无核酸酶的水组成体积为20μL。对于总HCoV，实时PCR在95℃下进行5 min，然后在95℃下进行45次循环15 s，在60℃下进行1 min。对于物种229E/OC43/NL63/HKU1，在95℃下进行5 min实时PCR，然后在95℃下进行45次循环15 s，在55℃下进行1 min。然后进行45个循环，分别是95℃持续30 s，55℃15 s，60℃45 s。所有实时PCR反应均在ABI 7500实时PCR系统（美国Applied Biosystems）上进行。用于反应的引物如下，见表1。