《表3 特异性扩增同源臂引物》

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《利用CRISPR/Cas9技术构建KMT2D基因敲除的人胚胎干细胞系》

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根据上述检验，确认了切割效率最高的sgRNA，即确定了切割位点在选定的sgRNA的NGG上游3～4 bp之间，在基因组序列中切割位点两侧分别设计引物，在5arm的反向引物的5’端前再添加序列5'-TCATTACTA-3'，用于形成终止密码子，使蛋白翻译提前终止从而实现基因的敲除。之后PCR扩增分别得到5arm和3arm。根据先插入的片段不能包含后续酶切位点序列的原则，以Donor-Puro与Donor-Hygro为原始载体，采用两步法分别同源重组替换原始载体的3arm和5arm。设计引物以HN4基因组为模版分别特异性扩增3arm和5arm片段，引物序列见表3。PCR条件为:2×Phanta Max Buffer25μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，dNTP Mix 1μL，Primers（F+R）4μL，HN4 Genome 1μL，ddH2O补至50μL，PCR程序如下:98℃预变性3 min；98℃变性15 s，65℃退火15 s，72℃延伸1 min，2～4步共35个循环；72℃延伸5 min。选用SalⅠ和Bam HⅠ酶切Donor-Puro与DonorHygro，回收目的片段与3arm同源重组，得到重组质粒Donor-KMT2D-3arm-Puro和Donor-KMT2D-3arm-Hygro。之后采用同样的方法改造上一步得到的质粒，替换其5arm。最终得到含有KMT2D SET Domain两端同源臂和不同抗性的重组质粒Donor-KMT2D-KO-Puro和Donor-KMT2D-KO-Hygro。