《表3 基因编辑T0代单株编辑结果总结》

  提示：宽带有限、当前游客访问压缩模式

本系列图表出处文件名：随高清版一同展现

《优质早籼不育系HD9802S不育基因tms5的遗传分析及应用研究》

1. 获取 高清版本忘记账户？点击这里登录

1. 下载图表忘记账户？点击这里登录

为更进一步从遗传上证明TMS5基因控制育性，同时验证创建新的不育系的可能，我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除R287中TMS5基因．针对TMS5基因序列，我们在基因的第一个外显子内设计2个基因打靶靶点（Target 1:GAAGAGGAACTCCTGCGAGACGG；Target 2:GCTCGGACTGGTCCATGGAGCGG），将2个靶点的表达盒同时构建到转化载体p YLCRISPR/Cas9-MH上，转化R287．用于构建载体的相关引物见表1，构建完成的基因编辑载体T-DNA上基因结构图如图2C，打靶位点的碱基顺序见图2D.2019年4月我们从公司获得独立阳性转基因单株5株，并于2019年6月在武汉种植，同期种植2行20株R287作对照，10月观察表型，结果显示20株R287完全可育，而5株T0代转基因单株都完全不育．针对这5株转基因单株，我们首先在2个编辑靶点两端设计引物gTMS5-F1及gTMS5-R1（表1），PCR扩增并测序，结果显示除第2号单株测序序列可读，剩余4个单株在靶点位置开始出现双峰，说明在靶点位点有编辑发生．为进一步确定每个单株具体的编辑情况，对4个测序出现双峰的单株的PCR产物进行TA克隆，再随机挑4个单克隆测序，测序结果显示5个单株都有不同情况的编辑，具体每个单株的编辑情况见图4，编辑后造成的影响见表3．从编辑结果分析，5个T0代转基因单株都造成TMS5编码蛋白的改变，很可能造成蛋白功能失活；从表型上看，5个单株的确都不育，由此我们确定TMS5功能失活可使R287由可育变不育．