《表1 实时荧光定量PCR基因引物》

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《苯并芘和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯复合暴露对稀有鮈鲫的内分泌干扰效应研究》

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雌雄鱼各不同组织（每个平行由2条鱼的样品合并而成）总RNA提取、纯化、定量及c DNA合成法参照Wang等[19]的方法。为避免基因组DNA的污染，初提取物的总RNA用RNase和DNase I进行消化并纯化。用分光光度计测定样品在260和280nm下的吸光值，同时用1%的琼脂糖凝胶电泳进一步检测RNA的浓度，取1μg总RNA进行反转录得到c DNA，用SYBR Green I染料法对目标基因进行定量检测（ABI 7300，Applied Biosystem，USA）。反应体系为20μL，其中包括SYBR Green PCR master mix（Toyobo，Japan）10μL、ROX 0.4μL、5μmol·L-1正义和反义引物各0.5μL及c DNA 1μL和7.6μL ddH2O。实时定量PCR程序为:95℃预变性10min；95℃变性30 s，58℃复性20 s，72℃延伸1 min，40个循环。内参基因选择β-actin，内参及目标基因引物序列通过软件Primer 5（http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/）设计，引物序列见表1。所有样品的定量检测至少重复3次，每次3个平行。以2-ΔΔCt法计算目标基因m RNA的相对表达量[20]。