《表1 PCR引物序列：新生大鼠松果体细胞体外分离培养及增殖情况观察》

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《新生大鼠松果体细胞体外分离培养及增殖情况观察》

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间隔1 d后利用倒置显微镜来查看体外松果体细胞整体的变化情况。随后抽取经过培养1周的原代松果体细胞，严格按照免疫荧光法进行5-HT、MAP-2鉴定。利用室温PBS反复轻轻漂洗3次，5 min/次，再经室温4%多聚甲醛中固定0.5 h，控制室温让其晾干，PBS反复清洗3次，10 min/次，0.1%Triton-100浸润10 min，PBS反复清洗3次，10 min/次，随后在每个孔注入剂量为200μL的FBS，将其在室温封闭至少1 h，随后弃去血清，并将1︰100的兔抗鼠5-HT（Ⅰ抗）200μL将入其中，放置于温度为4℃的室内过夜，PBS反复清洗3次，10 min/次；最后将1︰500 FITC标记的羊抗兔IgG（Ⅱ抗）200μL加入其中，放置于背光的室温内进行1 h的孵育，PBS反复清洗3次，5 min/次；随后进行DAPI染核（1︰2 000），放置于背光的室温内进行2 min的孵育；最后做同型对照，不加Ⅰ抗，余步骤同前，甘油封片，荧光显微镜下观察松果体细胞5-HT、MAP-2。分别取培养7、14、21、28 d的松果体细胞，TRIzol法提取总RNA，逆转录生成cRNA，采用实时定量PCR法测定大鼠松果体细胞中AANAT及SS mRNA。以GADPH为内参，根据GenBank中调取的大鼠AANAT、SS和GADPH完整c DNA序列，利用Primer 5.0引物设计软件设计PCR引物，PCR引物序列见表1。反应体系：cDNA 2μL，SYBR Green PCR minasterMix 20μL，AANAT、SS和GAPDH上下游引物各1μL，反应总体积20μL。反应条件：95℃预热、10 min，95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、30 s，72℃收集荧光，共45个循环。运用LightCyler 480软件进行实时数据收集和定量分析，采用公式2-ΔΔCt法计算各样本中AANAT及SS mRNA的相对表达量。