《表1 本研究网状车轮虫3株系18S rDNA和ITS-5.8S rDNA序列登录号》

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《基于18S rDNA与ITS-5.8S rDNA对重庆地区网状车轮虫的种内分化研究》

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使用玻璃微量移液管分离单只活体网状车轮虫，置于1.5 ml EP管中用无菌水洗涤数次，按照REDExtract-N-AmpTM Tissue PCR Kit(Sigma，St.Louis MO）试剂盒说明书提取样本DNA，保存于﹣20℃备用。本研究18S r DNA序列的扩增引物为：正向引物82F(5′-GAA ACT GCG AAT GGC TC-3′）、反向引物LSUR(5′-GTT AGT TTC TTT TCC TCC GC-3′）（Utz et al.2007）。PCR反应体系为：94℃预变性1 min，56℃退火2 min，72℃延伸2 min，进行5个循环；然后94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。ITS-5.8S rDNA扩增引物为：正向引物ERIB10-V(5′-CCG TAG GTG AAC CTG CGG AAG-3′）和反向引物28S1R(5′-GTG TTT CAA GAC GGG TCG-3′）（Wang et al.2019）。PCR反应体系为：94℃预变性5 min，95℃变性45 s，56℃退火50 s，72℃延伸1.5 min，进行35个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳分离，于Gel Doc XR凝胶成像系统中检测条带。切胶后按照Gel Extraction Kit(150）试剂盒进行纯化，测序工作由英潍捷基（上海）贸易有限公司的测序仪完成。本研究所测定网状车轮虫3株系的18S r DNA与ITS-5.8S r DNA序列提交于GenBank（表1）。