《表2 按蚊间日疟原虫和恶性疟原虫子孢子检测引物序列》

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《云南省边境地区景洪市疟疾媒介调查》

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取捕获按蚊的头胸部，参照《消除疟疾技术方案（2011年版）》[9]匀浆法提取DNA，使用巢式PCR检测疟原虫子孢子感染情况[10-12]。本研究操作参照疟疾诊断参比实验室工作手册[13]，由于三日疟原虫（P.malariae）和卵形疟原虫（P.ovale）感染按蚊可能性较小，本研究只检测间日疟原虫（P.vivax）和恶性疟原虫（P.falciparum）子孢子。参考文献[14]，以ssRNA基因为检测靶标设计引物，由美国Invitrogen公司合成（表2）。巢式PCR第一轮采用疟原虫通用引物进行扩增，反应体系为:属特异性引物1和2各0.7μl（20μmol/L），2×Taq预混液14μl，DNA模板2.6μl，ddH2O 7μl；第二轮采用疟原虫特异性引物进行扩增，反应体系为:间日疟原虫/恶性疟原虫异性引物1和2各0.7μl（20μmol/L），2×Taq预混液14μl，第一轮反应产物1.6μl，ddH2O 8μl。第一轮、第二轮反应条件均设定为94℃3 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃40 s，共65个循环；72℃5 min。